جینیاتی بیماریاں اب بھی ایک عالمی چیلنج ہیں، کیونکہ یہ جینوں میں ہونے والے تغیرات کی وجہ سے ہوتی ہیں جو حیاتیاتی افعال، میٹابولک عمل، یا افراد کے بعض ضروری پروٹینوں کی پیداوار کو مختلف وراثتی عوارض سے متاثر کرتی ہیں۔ جین تھراپی دوائیں علاج کی مداخلت کی ایک قسم ہیں جو مخصوص جینوں کو نشانہ بناتی ہیں، ان کی مرمت یا ترمیم کرنے کا مقصد، اور خلیات کو فعال پروٹین تیار کرنے یا بیماریوں کا سبب بننے والے جین کی خرابیوں میں مداخلت کرنے کے لیے نئی ہدایات فراہم کرتی ہیں۔
عام جین ادویات میں بنیادی طور پر ڈی این اے اور آر این اے شامل ہیں، جہاں ڈی این اے جین کے ٹکڑے یا علاج کے اثرات کے ساتھ جین کی ترتیب ہو سکتی ہے۔ یہ ڈی این اے عیب دار یا گمشدہ جین کے افعال کو تبدیل کرنے یا ان کی تکمیل کے لیے خلیات کو پہنچایا جاتا ہے۔ آر این اے میسنجر آر این اے (ایم آر این اے)، چھوٹا مداخلت کرنے والا آر این اے (سی آر این اے)، یا اینٹی سینس اولیگونوکلیوٹائڈس (اے ایس او) وغیرہ ہوسکتا ہے، جو نقصان دہ جینوں کے اظہار کو روکنے، یا مخصوص جینز کے کام کو بحال کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔
تاہم، ڈی این اے اور آر این اے دونوں کو انسانی جسم میں داخل ہونے سے لے کر ہدف کے خلیات تک پہنچنے تک بہت سے چیلنجز کا سامنا ہے۔ چونکہ معدے کی نالی میں جین کی ترتیب غیر مستحکم ہوتی ہے، اس لیے وہ عام طور پر نس یا ذیلی انجیکشن کے ذریعے لگائی جاتی ہیں، لیکن اس کے باوجود، زیادہ تر جین کی ترتیب انسانی جسم میں وافر نیوکلیز کی وجہ سے اب بھی خراب ہوتی ہے۔
جب بقایا جین ادویات کی تھوڑی مقدار ہدف کے خلیات کے باہر تک پہنچ جاتی ہے، تو وہ خلیات میں داخل نہیں ہو سکتیں کیونکہ جین کی ترتیب فاسفیٹ گروپس کے ساتھ بڑے مالیکیولز ہوتے ہیں جن میں منفی چارجز ہوتے ہیں، جب کہ سیل کی جھلی بھی منفی چارجز لے کر جاتی ہے۔ جب دو منفی چارجز ملتے ہیں، تو جینز کو پیچھے ہٹا دیا جاتا ہے اور خلیات میں داخل نہیں ہو سکتے۔ لہذا، ہمیں Vivo میں ان کے انحطاط کو روکنے اور سیل جھلی کے دخول کی کارکردگی کو بہتر بنانے، اور DNA یا RNA کی ترتیب کو خلیات تک آسانی سے پہنچانے کے لیے مخصوص جین منشیات کی ترسیل کے طریقے تیار کرنے کی ضرورت ہے۔
جین دوائیوں کی ترسیل کے طریقے
موجودہ عام جین کی ترسیل کے طریقوں کو بنیادی طور پر دو قسموں میں تقسیم کیا گیا ہے: وائرل ویکٹر ڈیلیوری اور غیر-وائرل ویکٹر ڈیلیوری۔ وائرل ویکٹر ڈیلیوری میں بنیادی طور پر ایڈینو-اسوسی ایٹڈ وائرس (AAV) اور lentivirus وغیرہ شامل ہوتے ہیں، جو میزبان خلیوں کے وائرس انفیکشن کے عمل کو نقل کر سکتے ہیں اور سیل کی رکاوٹوں کو آسانی سے عبور کر سکتے ہیں، اس طرح اعلیٰ ترسیل کی کارکردگی کو حاصل کیا جا سکتا ہے۔ تاہم، وائرل ویکٹر کی ترسیل میں بھی مسائل ہیں: سب سے پہلے، اس میں پیکیجنگ کی محدود صلاحیت ہے، جیسے کہ AAV کی زیادہ سے زیادہ پیکیجنگ کی گنجائش 4.7kb ہے، جو طویل جین کی ترتیب نہیں دے سکتی؛ دوم، وائرل ویکٹر سنگین مدافعتی رد عمل کا سبب بن سکتے ہیں، بشمول سیلولر استثنیٰ اور مزاحیہ استثنیٰ، جو کلینیکل ایپلی کیشنز کے لیے خطرات پیدا کرتے ہیں۔ اس کے مقابلے میں، غیر-وائرل ویکٹر کے حفاظت اور منشیات کی لوڈنگ کی صلاحیت میں بہت زیادہ فوائد ہیں۔
موجودہ عام طور پر استعمال کیے جانے والے غیر-وائرل ویکٹرز میں بنیادی طور پر لیپوسومز، پولیمر، نینو پارٹیکلز، ایکزوسومز وغیرہ شامل ہیں، جن میں سے لیپوسومز 100nm سے 1um تک کے قطر والے ایمفیفیلک مالیکیولز کے ذریعے بنتے ہیں۔ وہ بنیادی طور پر فاسفولیپڈز، کولیسٹرول، پی ای جی لپڈس اور کیشنک لپڈس پر مشتمل ہوتے ہیں۔ فاسفولیپڈ بیلیئر کی ساخت سیل جھلیوں کی طرح ہے اور اینڈوسیٹوسس کے ذریعے آسانی سے خلیوں میں داخل ہوسکتی ہے۔ اس کے علاوہ، لیپوسومز مخصوص ٹشوز یا خلیات کو نشانہ بناتے ہوئے جسم کے مدافعتی کلیئرنس سے بچنے کے لیے اپنی سطحوں پر پی ای جی یا مخصوص اینٹی باڈیز کو بھی تبدیل کر سکتے ہیں۔ Cationic liposomes liposomes ہیں جن میں مثبت چارج شدہ quaternary ammonium salt lipids ہوتے ہیں، جو منفی چارج شدہ نیوکلک ایسڈ ادویات کے ساتھ بہتر طور پر باندھ سکتے ہیں اور ترسیل کے نظام کے استحکام کو برقرار رکھ سکتے ہیں۔ لہذا، لیپوسومز جین ادویات کے لیے عام غیر- وائرل ویکٹر کی ترسیل کے طریقوں میں سے ایک ہیں۔
تاہم، روایتی لیپوسومز میں بھی کچھ مسائل ہوتے ہیں: سب سے پہلے، لیپوزوم قطر کے بڑے دورانیے کی وجہ سے، اگرچہ یہ کافی منشیات کی لوڈنگ کی صلاحیت کو یقینی بنا سکتا ہے، جب لیپوسومز عروقی اینڈوتھیلیل گیپ (100-200nm) سے گزرتے ہیں، تو بہت بڑا سائز اس عمل میں رکاوٹ بنے گا۔ مزید برآں، جب لیپوسومز اینڈو سائیٹوسس کے ذریعے خلیات میں داخل ہوتے ہیں اور اینڈوسوم-لائسوسوم سسٹم بناتے ہیں، تو روایتی لیپوسومز وقت میں لائسوسومل فرار کو مکمل نہیں کر پاتے، جس کے نتیجے میں زیادہ تر جین کی دوائیں لائزوسومز کے ذریعے انحطاط پذیر ہوتی ہیں اور اپنے اثرات مرتب کرنے سے قاصر ہوتی ہیں۔ جین کی دوائیں فراہم کرنے میں روایتی لیپوسومز کی ان کوتاہیوں کی بنیاد پر، لپڈ نینو پارٹیکلز (LNP) کو تیار کیا گیا ہے اور یہ ایک اہم ترسیل کا طریقہ بن گیا ہے جو خاص طور پر خلیات اور بافتوں کو نشانہ بنانے کے لیے نیوکلک ایسڈ فراہم کرنے کے لیے موزوں ہے۔
ایل این پی کیریئر سسٹم کا تعارف
لپڈ نینو پارٹیکلز (LNP) نینو پارٹیکلز ہیں جو لپڈ-جیسے مادوں پر مشتمل ہوتے ہیں اور اس کا قطر عام طور پر 10-200nm کے درمیان ہوتا ہے۔ روایتی لیپوسومز کے مقابلے میں، وہ چھوٹے اور عروقی انڈوتھیلیل خلا سے گزرنا آسان ہیں۔ اس کے علاوہ، LNP عام طور پر cationic/ionizable lipids، auxiliary phospholipids، polyethylene glycol (PEG) lipids اور کولیسٹرول پر مشتمل ہوتا ہے۔ ان میں سے، معاون فاسفولپائڈز اور کولیسٹرول ایل این پی کے استحکام کو بڑھا سکتے ہیں؛ پی ای جی لپڈز Vivo میں LNP کی گردش کا وقت بڑھانے اور مدافعتی ردعمل کو کم کرنے میں مدد کرتے ہیں۔ یہ اجزاء روایتی لیپوسومز کی طرح کام کرتے ہیں۔ فرق cationic/ionizable lipids میں ہے، جو LNP کے لیے پیٹنٹ کے تحفظ کا اہم شعبہ بھی ہیں۔
جیسا کہ پہلے ذکر کیا گیا ہے، cationic liposomes مؤثر طریقے سے نیوکلک ایسڈ دوائیوں کے ساتھ بائنڈنگ کو برقرار رکھ سکتے ہیں اور نیوکلک ایسڈ ادویات کی ترسیل کی کارکردگی کو بہتر بنا سکتے ہیں۔ تاہم، cationic liposomes جسم کی گردش میں منفی چارج شدہ پلازما پروٹین، خون کے خلیات وغیرہ کے ساتھ غیر مخصوص پابند ہونے کا خطرہ بھی رکھتے ہیں، جس کی وجہ سے liposome جمع ہوتے ہیں اور جسم سے جلدی سے خارج ہو جاتے ہیں (vivo میں cationic liposomes کی نصف زندگی صرف 15 منٹ ہے)۔
اس مسئلے کو حل کرنے کے لیے محققین نے لپڈ مواد کی ایک نئی قسم تیار کی ہے جسے ionizable lipids کہتے ہیں۔ Ionizable lipids ساخت میں cationic lipids سے بہت ملتے جلتے ہیں۔ مثال کے طور پر عام cationic lipid DOTAP اور ionizable lipid DODAP کو لے کر، فرق یہ ہے کہ DOTAP مثبت چارج کے ساتھ ایک چوتھائی امونیم نمک ہے، جبکہ DODAP ایک ترتیری امائن ڈھانچہ ہے۔ ترتیری امائن ڈھانچہ لپڈ کے pKa کو 6-7 کے درمیان رکھ سکتا ہے۔ جب pH pKa سے کم ہوتا ہے (تیزابی حالات میں)، ionizable lipids کو مثبت طور پر چارج کیا جاتا ہے۔
جب pH pKa کے قریب ہوتا ہے (غیر جانبدار حالات میں)، ionizable lipids غیر جانبدار ہوتے ہیں۔ یہ ڈیزائن بڑی چالاکی کے ساتھ cationic liposomes کے درپیش مسئلے کو حل کر سکتا ہے: چونکہ خون کی گردش میں pH غیر جانبدار کے قریب ہے، اس لیے ionizable lipids بھی غیر جانبدار ہیں، اور ان کے اور پلازما پروٹین یا خون کے خلیوں کے درمیان غیر مخصوص بائنڈنگ نمایاں طور پر کم ہو جاتی ہے، جس سے نصف-زندگی بڑھ جاتی ہے۔ مزید برآں، جب ionizable lipid LNP کو خلیات کے ذریعے لیا جاتا ہے اور لائسوزوم میں داخل ہوتے ہیں، تو lipids ionized ہوتے ہیں اور lysosomal ماحول میں pH 5-6 کے ساتھ مثبت چارج ہوتے ہیں۔ مثبت طور پر چارج شدہ لپڈ آسانی سے اینڈوسوم-لائسوسوم جھلی کے ساتھ مل جاتے ہیں، جس سے لیپوسومز کو سائٹوپلازم تک پہنچنے، نیوکلک ایسڈ کو الگ کرنے اور چھوڑنے کی اجازت ملتی ہے، اس طرح ان کے اثرات مرتب ہوتے ہیں۔ خلاصہ طور پر، LNP کیریئر سسٹم کو ڈیزائن کرنے میں موثر جین کی ترسیل کو حاصل کرنے کے لیے لپڈ کمپوزیشن، پارٹیکل سائز، سطح کے چارج اور استحکام کو بہتر بنانا شامل ہے۔
ایل این پی-پیکیجڈ جین ڈرگز کے لیے LCMS حیاتیاتی تجزیہ کی حکمت عملی
LNP-پیکیج شدہ جین دوائیں بنیادی طور پر LNP شیل اور خود جین دوائیوں پر مشتمل ہوتی ہیں۔ LNP شیل بنیادی طور پر لپڈ اجزاء پر مشتمل ہوتا ہے (cationic/ionizable lipids کا حصہ تقریباً 30-50%، PEG lipids تقریباً 2%، کولیسٹرول تقریباً 20-50%، معاون فاسفولیپڈز تقریباً 10-20% ہوتا ہے)، جب کہ بنیادی طور پر gene equines of gene equences، 20%. ASO، siRNA اور miRNA، وغیرہ)۔ NMPA اور FDA[14-15] کے تازہ ترین ضوابط کے مطابق، LNP جیسی دوائیوں کی ترسیل کے نظام کے IND اطلاق کے لیے، فعال اجزاء (جین کی ترتیب) پر فارماسولوجیکل اور فارماکوکینیٹک اسٹڈیز کرنے کے علاوہ، حفاظتی اور دواسازی کی تشخیص بھی ضروری ہے، نئے لیپڈ اجزاء کے طور پر منشیات کی ترسیل کے نظام میں استعمال نہیں کیے گئے ہیں LNP میں خصوصی ترمیم کے ساتھ cationic/ionizable lipids اور PEG lipids۔
LNP لپڈز کا LCMS بائیو اینالائسز cationic/ionizable lipids اور PEG lipids پر فوکس کرتا ہے۔ ان کے درمیان ساختی اختلافات کی وجہ سے، cationic/ionizable lipid مالیکیولر وزن عام طور پر 1 kDa کے اندر ہوتا ہے، جبکہ PEG لپڈ مالیکیولر وزن ترمیمی گروپوں کو لے جانے کے بعد 2~ 5 kDa تک پہنچ سکتا ہے، جس کے نتیجے میں ان کے درمیان کرومیٹوگرافک برقرار رکھنے اور بڑے پیمانے پر سپیکٹرومیٹری ردعمل میں بڑے فرق ہوتے ہیں۔ اس بات پر غور کرتے ہوئے کہ LNP میں cationic/ionizable lipid کا مواد PEG lipid سے زیادہ ہے، ردعمل کا فرق دونوں کے علاج کے طریقہ کار کو مؤثر طریقے سے یکجا کرنے میں ناکامی کا باعث بنتا ہے (ایکسٹرکشن سالوینٹس کا انتخاب، dilution factor کا تعین)۔ اس کے علاوہ، پی ای جی لپڈ کی چوٹی کی پوزیشن کے ارد گرد مداخلت کرنے والی بہت سی چوٹیوں کی موجودگی کی وجہ سے، مؤثر علیحدگی کے لیے اکثر لمبا مائع فیز سیپریشن گریڈینٹ درکار ہوتا ہے، جو اعلیٰ تجزیہ کی کارکردگی کی ضمانت نہیں دے سکتا۔ لہذا، ہم الگ الگ بایو تجزیہ میں پی ای جی لپڈ کا پتہ لگانے کا طریقہ قائم کرتے ہیں۔ ایک ہی وقت میں، cationic/ionizable lipid اور PEG lipid کو بھی ان کے لپڈ اجزاء کی وجہ سے طریقہ کار کی نشوونما میں عام مشکلات ہیں، جیسے کہ پانی میں حل پذیری، حیاتیاتی میٹرکس میں عدم استحکام، حد سے زیادہ بحالی کے لیے پروٹین کا پابند ہونا، PEG lipid کی زیادہ مداخلت اور باقیات، matrix کے اندرونی نمونے میں استحکام کی تبدیلی اور matrix کے اندرونی انتخاب میں مشکل۔
